ՊՇՌ ռեակցիաներում խանգարող գործոններ

ՊՇՌ ռեակցիայի ընթացքում հաճախ հանդիպում են որոշ խանգարող գործոններ։
ՊՇՌ-ի շատ բարձր զգայունության պատճառով, աղտոտումը համարվում է ՊՇՌ արդյունքների վրա ազդող ամենակարևոր գործոններից մեկը և կարող է կեղծ դրական արդյունքներ տալ։
Նույնքան կարևոր են կեղծ-բացասական արդյունքների հանգեցնող տարբեր աղբյուրները: Եթե ՊՇՌ խառնուրդի մեկ կամ մի քանի կարևոր մասեր կամ ուժեղացման ռեակցիան ինքնին կասեցվեն կամ խանգարվեն, ախտորոշիչ անալիզը կարող է խոչընդոտվել: Սա կարող է հանգեցնել արդյունավետության նվազման և նույնիսկ կեղծ-բացասական արդյունքների:
Բացի արգելակումից, թիրախային նուկլեինաթթվի ամբողջականության կորուստ կարող է տեղի ունենալ նմուշի պատրաստումից առաջ տեղափոխման և/կամ պահպանման պայմանների պատճառով: Մասնավորապես, բարձր ջերմաստիճանները կամ անբավարար պահպանումը կարող են հանգեցնել բջիջների և նուկլեինաթթուների վնասման: Բջիջների և հյուսվածքների ֆիքսացիան և պարաֆինի ներդրումը ԴՆԹ-ի մասնատման հայտնի պատճառներ են և մշտական ​​խնդիր են (տե՛ս նկար 1 և 2): Այս դեպքերում նույնիսկ օպտիմալ մեկուսացումը և մաքրումը չեն օգնի:

Նկար 1 | Անշարժացման ազդեցությունը ԴՆԹ-ի ամբողջականության վրա
Ագարոզային գելի էլեկտրոֆորեզը ցույց տվեց, որ դիահերձման պարաֆինային հատվածներից մեկուսացված ԴՆԹ-ի որակը զգալիորեն տարբերվում էր: Քաղվածքներում առկա էր տարբեր միջին բեկորների երկարության ԴՆԹ՝ կախված ֆիքսացիայի մեթոդից: ԴՆԹ-ն պահպանվել է միայն այն ժամանակ, երբ ֆիքսվել է բնական սառեցված նմուշներում և բուֆերային չեզոք ֆորմալինում: Ուժեղ թթվային Բուենի ֆիքսատորի կամ չբուֆերային, մրջնաթթու պարունակող ֆորմալինի օգտագործումը հանգեցրել է ԴՆԹ-ի զգալի կորստի: Մնացած ֆրակցիան խիստ մասնատված է:
Ձախ կողմում բեկորների երկարությունը արտահայտված է կիլոբազային զույգերով (կբ/պ):

Նկար 2 | Նուկլեինաթթվային թիրախների ամբողջականության կորուստ
(ա) Երկու շղթաների վրա 3′-5′ բացը կհանգեցնի թիրախային ԴՆԹ-ի խզման։ ԴՆԹ-ի սինթեզը դեռևս տեղի կունենա փոքր բեկորի վրա։ Սակայն, եթե ԴՆԹ բեկորի վրա բացակայում է պրայմերի թրծման տեղամասը, տեղի է ունենում միայն գծային ուժեղացում։ Առավել բարենպաստ դեպքում բեկորները կարող են վերահագեցնել միմյանց, բայց ելքերը կլինեն փոքր և հայտնաբերման մակարդակից ցածր։
(բ) Հիմքերի կորուստը, հիմնականում դեպուրինացման և թիմիդինի դիմերի առաջացման պատճառով, հանգեցնում է H-կապերի քանակի նվազմանը և Tm-ի նվազմանը: Երկարացված տաքացման փուլի ընթացքում պրայմերները կհալվեն մատրիցային ԴՆԹ-ից և չեն թրծվի նույնիսկ ավելի մեղմ պայմաններում:
(գ) Հարակից թիմինային հիմքերը կազմում են TT դիմեր։
Մոլեկուլային ախտորոշման մեջ հաճախ հանդիպող մեկ այլ տարածված խնդիր է թիրախային նուկլեինաթթուների ոչ այնքան օպտիմալ արտազատումը՝ համեմատած ֆենոլ-քլորոֆորմի արդյունահանման հետ։ Ծայրահեղ դեպքերում սա կարող է կապված լինել կեղծ բացասական արդյունքների հետ։ Բջջային մնացորդների եռացման կամ ֆերմենտատիվ մարսման միջոցով կարելի է շատ ժամանակ խնայել, սակայն այս մեթոդը հաճախ հանգեցնում է ՊՇՌ-ի ցածր զգայունության՝ նուկլեինաթթվի անբավարար արտազատման պատճառով։

Պոլիմերազային ակտիվության արգելակում ամպլիֆիկացիայի ընթացքում

Ընդհանուր առմամբ, արգելակումը օգտագործվում է որպես տարայի հասկացություն՝ նկարագրելու բոլոր այն գործոնները, որոնք հանգեցնում են ոչ օպտիմալ ՊՇՌ արդյունքների: Խիստ կենսաքիմիական իմաստով, արգելակումը սահմանափակվում է ֆերմենտի ակտիվությամբ, այսինքն՝ այն նվազեցնում կամ կանխում է սուբստրատ-արտադրանքի փոխակերպումը՝ ԴՆԹ պոլիմերազի կամ դրա կոֆակտորի ակտիվ կենտրոնի հետ փոխազդեցության միջոցով (օրինակ՝ Mg2+՝ Taq ԴՆԹ պոլիմերազի համար):
Նմուշի բաղադրիչները կամ տարբեր բուֆերները և ռեակտիվներ պարունակող քաղվածքները կարող են ուղղակիորեն արգելակել ֆերմենտը կամ որսալ դրա կոֆակտորները (օրինակ՝ EDTA), այդպիսով ապաակտիվացնելով պոլիմերազը և, իր հերթին, հանգեցնելով ՊՇՌ արդյունքների նվազման կամ կեղծ բացասական արդյունքների։
Այնուամենայնիվ, ռեակցիայի բաղադրիչների և թիրախ պարունակող նուկլեինաթթուների միջև շատ փոխազդեցություններ նույնպես նշանակվում են որպես «ՊՇՌ ինհիբիտորներ»: Երբ բջջի ամբողջականությունը խաթարվում է մեկուսացման միջոցով, և նուկլեինաթթուն ազատվում է, կարող են տեղի ունենալ փոխազդեցություններ նմուշի և դրա շրջակա լուծույթի ու պինդ փուլի միջև: Օրինակ, «հավաքիչները» կարող են կապվել միաշղթա կամ երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ ոչ կովալենտ փոխազդեցությունների միջոցով և խանգարել մեկուսացմանը և մաքրմանը՝ նվազեցնելով ՊՇՌ ռեակցիայի անոթին ի վերջո հասնող թիրախների քանակը:
Ընդհանուր առմամբ, ՊՇՌ ինհիբիտորները առկա են մարմնի հեղուկների և կլինիկական ախտորոշիչ թեստերի համար օգտագործվող ռեակտիվների մեծ մասում (միզանյութ մեզի մեջ, հեմոգլոբին և հեպարին արյան մեջ), սննդային հավելումներում (օրգանական բաղադրիչներ, գլիկոգեն, ճարպ, Ca2+ իոններ) և շրջակա միջավայրի բաղադրիչներում (ֆենոլներ, ծանր մետաղներ):

Ավելի տարածված ՊՇՌ ինհիբիտորները կարելի է գտնել մանրէներում և էուկարիոտ բջիջներում, ոչ թիրախային ԴՆԹ-ում, հյուսվածքային մատրիցների ԴՆԹ-կապող մակրոմոլեկուլներում և լաբորատոր սարքավորումներում, ինչպիսիք են ձեռնոցները և պլաստմասսաները: ՊՇՌ ինհիբիտորները հեռացնելու նախընտրելի մեթոդը նուկլեինաթթուների մաքրումն է արդյունահանման ընթացքում կամ դրանից հետո:
Այսօր տարբեր ավտոմատացված արդյունահանման սարքավորումները կարող են փոխարինել բազմաթիվ ձեռքով կատարվող արձանագրություններին, սակայն թիրախների 100% վերականգնումը և/կամ մաքրումը երբեք չի իրականացվել: Հավանական ինհիբիտորները կարող են դեռևս առկա լինել մաքրված նուկլեինաթթուներում կամ արդեն իսկ ազդեցություն են ունեցել: Կան տարբեր ռազմավարություններ ինհիբիտորների ազդեցությունը նվազեցնելու համար: Համապատասխան պոլիմերազի ընտրությունը կարող է զգալի ազդեցություն ունենալ ինհիբիտորային ակտիվության վրա: ՊՇՌ ինհիբիտորումը նվազեցնելու այլ ապացուցված մեթոդներ են պոլիմերազի կոնցենտրացիայի ավելացումը կամ հավելումների, ինչպիսիք են BSA-ն, կիրառումը:
ՊՇՌ ռեակցիաների արգելակումը կարող է ցույց տրվել ներքին գործընթացի որակի վերահսկողության (IPC) միջոցով։
Անհրաժեշտ է զգույշ լինել արդյունահանման հավաքածուի մեջ առկա բոլոր ռեակտիվները և այլ լուծույթները, ինչպիսիք են էթանոլը, EDTA-ն, CETAB-ը, LiCl-ը, GuSCN-ը, SDS-ը, իզոպրոպանոլը և ֆենոլը, նուկլեինաթթվի մեկուսիչից հեռացնելու հարցում՝ մանրակրկիտ լվացման փուլով: Կախված դրանց կոնցենտրացիայից՝ դրանք կարող են ակտիվացնել կամ արգելակել ՊՇՌ-ը: