Միջամտության գործոնները PCR ռեակցիաներում

PCR ռեակցիայի ժամանակ հաճախ հանդիպում են որոշ խանգարող գործոններ:
ՊՇՌ-ի շատ բարձր զգայունության պատճառով աղտոտումը համարվում է ՊՇՌ արդյունքների վրա ազդող ամենակարևոր գործոններից մեկը և կարող է կեղծ դրական արդյունքներ տալ:
Նույնքան կարևոր են տարբեր աղբյուրները, որոնք հանգեցնում են կեղծ բացասական արդյունքների: Եթե ​​PCR խառնուրդի մեկ կամ մի քանի էական մասեր կամ բուն ուժեղացման ռեակցիան արգելակվում կամ խանգարվում են, ապա ախտորոշիչ վերլուծությունը կարող է խոչընդոտվել: Սա կարող է հանգեցնել արդյունավետության նվազման և նույնիսկ կեղծ բացասական արդյունքների:
Ի հավելումն արգելակման, թիրախային նուկլեինաթթվի ամբողջականության կորուստը կարող է առաջանալ առաքման և/կամ պահպանման պայմանների պատճառով մինչև նմուշի պատրաստումը: Մասնավորապես, բարձր ջերմաստիճանը կամ անբավարար պահեստավորումը կարող է հանգեցնել բջիջների և նուկլեինաթթուների վնասմանը: Բջիջների և հյուսվածքների ամրագրումը և պարաֆինի ներկառուցումը ԴՆԹ-ի մասնատման և մշտական ​​խնդրի հայտնի պատճառներն են (տես Նկարներ 1 և 2): Այս դեպքերում նույնիսկ օպտիմալ մեկուսացումն ու մաքրումը չեն օգնի:

Գծապատկեր 1 | Անշարժացման ազդեցությունը ԴՆԹ-ի ամբողջականության վրա
Ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզը ցույց տվեց, որ դիահերձումների պարաֆինային հատվածներից մեկուսացված ԴՆԹ-ի որակը զգալիորեն տարբերվում էր: Կախված ֆիքսման մեթոդից, քաղվածքներում առկա էր տարբեր միջին երկարությունների բեկորների ԴՆԹ: ԴՆԹ-ն պահպանվել է միայն այն դեպքում, երբ ամրագրվել է բնական սառեցված նմուշներում և բուֆերացված չեզոք ֆորմալինի մեջ: Խիստ թթվային Bouin ֆիքսատորի կամ չբուֆերացված, մածուցիկ թթու պարունակող ֆորմալինի օգտագործումը հանգեցրել է ԴՆԹ-ի զգալի կորստի: Մնացած մասնաբաժինը խիստ մասնատված է:
Ձախ կողմում բեկորների երկարությունը արտահայտված է կիլոբազային զույգերով (kbp)

Գծապատկեր 2 | Նուկլեինաթթվի թիրախների ամբողջականության կորուստ
ա) Երկու շղթաների վրա 3'-5' բացը կհանգեցնի թիրախային ԴՆԹ-ի խզմանը: ԴՆԹ-ի սինթեզը դեռևս տեղի կունենա փոքր հատվածի վրա: Այնուամենայնիվ, եթե ԴՆԹ-ի հատվածի վրա բացակայում է այբբենարանի կռման տեղամասը, տեղի է ունենում միայն գծային ուժեղացում: Առավել բարենպաստ դեպքում բեկորները կարող են նորից հագեցնել միմյանց, բայց բերքատվությունը կլինի փոքր և ցածր հայտնաբերման մակարդակից:
բ) Հիմքերի կորուստը հիմնականում դեպուրինացիայի և թիմիդին դիմերի ձևավորման պատճառով հանգեցնում է H-կապերի քանակի նվազմանը և Tm-ի նվազմանը: Երկարատև տաքացման փուլում այբբենարանները կհալվեն մատրիցային ԴՆԹ-ից և չեն կռվի նույնիսկ ավելի քիչ խիստ պայմաններում:
գ) Հարակից տիմինային հիմքերը կազմում են TT դիմեր:
Մեկ այլ տարածված խնդիր, որը հաճախ հանդիպում է մոլեկուլային ախտորոշման մեջ, նպատակային նուկլեինաթթուների ոչ օպտիմալ արտազատումն է՝ համեմատած ֆենոլ-քլորոֆորմի արդյունահանման հետ: Ծայրահեղ դեպքերում դա կարող է կապված լինել կեղծ բացասականների հետ: Շատ ժամանակ կարելի է խնայել եռացող լուծույթով կամ բջջային մնացորդների ֆերմենտային մարսմամբ, սակայն այս մեթոդը հաճախ հանգեցնում է PCR ցածր զգայունության՝ նուկլեինաթթվի անբավարար արտազատման պատճառով:

Պոլիմերազի ակտիվության արգելակումը ուժեղացման ժամանակ

Ընդհանուր առմամբ, արգելակումը օգտագործվում է որպես կոնտեյներային հասկացություն՝ նկարագրելու բոլոր գործոնները, որոնք հանգեցնում են ոչ օպտիմալ PCR արդյունքների: Խիստ կենսաքիմիական իմաստով արգելակումը սահմանափակվում է ֆերմենտի ակտիվությամբ, այսինքն՝ այն նվազեցնում կամ կանխում է սուբստրատ-արտադրանքի փոխակերպումը ԴՆԹ պոլիմերազի կամ նրա կոֆակտորի ակտիվ տեղամասի հետ փոխազդեցության միջոցով (օրինակ՝ Mg2+ Taq ԴՆԹ պոլիմերազի համար):
Նմուշի բաղադրիչները կամ ռեակտիվներ պարունակող տարբեր բուֆերներ և էքստրակտներ կարող են ուղղակիորեն արգելակել ֆերմենտը կամ թակարդել նրա կոֆակտորները (օրինակ՝ EDTA)՝ դրանով իսկ անակտիվացնելով պոլիմերազը և իր հերթին հանգեցնելով PCR-ի նվազման կամ կեղծ բացասական արդյունքների:
Այնուամենայնիվ, ռեակցիայի բաղադրիչների և թիրախ պարունակող նուկլեինաթթուների միջև շատ փոխազդեցություններ նույնպես նշանակվում են որպես «PCR inhibitors»: Երբ բջիջի ամբողջականությունը խաթարվում է մեկուսացումից և նուկլեինաթթուն ազատվում է, նմուշի և դրա շրջակա լուծույթի և պինդ փուլի միջև փոխազդեցությունը կարող է տեղի ունենալ: Օրինակ, «հավաքարարները» կարող են կապել մեկ կամ երկշղթա ԴՆԹ ոչ կովալենտային փոխազդեցությունների միջոցով և խանգարել մեկուսացմանը և մաքրմանը` նվազեցնելով թիրախների թիվը, որոնք ի վերջո հասնում են PCR ռեակցիայի անոթին:
Ընդհանուր առմամբ, PCR ինհիբիտորները առկա են մարմնի հեղուկների և ռեակտիվների մեծ մասում, որոնք օգտագործվում են կլինիկական ախտորոշիչ թեստերի համար (միզում մեզի մեջ, հեմոգլոբին և հեպարին արյան մեջ), սննդային հավելումներ (օրգանական բաղադրիչներ, գլիկոգեն, ճարպեր, Ca2+ իոններ) և շրջակա միջավայրի բաղադրիչները (ֆենոլներ): ծանր մետաղներ)

Ավելի տարածված PCR ինհիբիտորները կարող են հայտնաբերվել բակտերիաների և էուկարիոտիկ բջիջների, ոչ նպատակային ԴՆԹ-ի, հյուսվածքների մատրիցների ԴՆԹ կապող մակրոմոլեկուլների և լաբորատոր սարքավորումների, ինչպիսիք են ձեռնոցները և պլաստիկները: Նուկլեինաթթուների մաքրումը արդյունահանման ընթացքում կամ դրանից հետո PCR ինհիբիտորների հեռացման նախընտրելի մեթոդն է:
Այսօր արդյունահանման տարբեր ավտոմատացված սարքավորումները կարող են փոխարինել բազմաթիվ ձեռքով արձանագրությունների, սակայն թիրախների 100% վերականգնումը և/կամ մաքրումը երբեք չի հաջողվել: Մաքրված նուկլեինաթթուներում պոտենցիալ ինհիբիտորները կարող են դեռ առկա լինել կամ արդեն ուժի մեջ են մտել: Կան տարբեր ռազմավարություններ՝ նվազեցնելու ինհիբիտորների ազդեցությունը: Համապատասխան պոլիմերազի ընտրությունը կարող է էական ազդեցություն ունենալ ինհիբիտորների գործունեության վրա: PCR-ի արգելակումը նվազեցնելու այլ ապացուցված մեթոդներ են պոլիմերազի կոնցենտրացիայի ավելացումը կամ հավելումների օգտագործումը, ինչպիսին է BSA-ն:
PCR ռեակցիաների արգելակումը կարող է դրսևորվել ներքին գործընթացի որակի վերահսկման (IPC) օգտագործմամբ:
Պետք է զգուշություն ցուցաբերել արդյունահանման հավաքածուի բոլոր ռեակտիվները և այլ լուծույթները, ինչպիսիք են էթանոլը, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, իզոպրոպանոլը և ֆենոլը, նուկլեինաթթվի մեկուսացումից մանրակրկիտ լվացման քայլով հեռացնելու համար: Կախված իրենց կոնցենտրացիայից, նրանք կարող են ակտիվացնել կամ արգելակել PCR: