Միջամտության գործոններ PCR- ի ռեակցիաներում

PCR- ի արձագանքի ընթացքում հաճախ բախվում են որոշ միջամտող գործոններ:
PCR- ի շատ բարձր զգայունության շնորհիվ աղտոտումը համարվում է PCR արդյունքների վրա ազդող ամենակարեւոր գործոններից մեկը եւ կարող է առաջացնել կեղծ դրական արդյունքներ:
Հավասարապես կրիտիկական են տարբեր աղբյուրներ, որոնք հանգեցնում են կեղծ բացասական արդյունքների: Եթե ​​PCR խառնուրդի մեկ կամ մի քանի էական մասերը կամ ուժեղացման ռեակցիան իրեն խանգարում կամ միջամտել են, ախտորոշիչ փորձարկումը կարող է խանգարել: Սա կարող է հանգեցնել արդյունավետության եւ նույնիսկ կեղծ բացասական արդյունքների:
Բացի խանգարումից, նպատակային նուկլեաթթվի ամբողջականության կորուստը կարող է առաջանալ բեռնափոխադրման եւ (կամ) պահպանման պայմանների պատճառով `նախքան նմուշների պատրաստումը: Մասնավորապես, բարձր ջերմաստիճանը կամ անբավարար պահեստը կարող է հանգեցնել բջիջների եւ նուկլեինաթթուների վնասների: Բջջային եւ հյուսվածքների ամրագրումը եւ պարաֆինի ներկառուցումը ԴՆԹ-ի մասնատման եւ համառ խնդրի հայտնի պատճառներ են (տես թվերը 1 եւ 2): Այս դեպքերում նույնիսկ օպտիմալ մեկուսացումը եւ մաքրումը չեն օգնի:

Գծապատկեր 1 | Անշարժացումի ազդեցությունը ԴՆԹ ամբողջականության վրա
Agarose GEL Electrophoresis- ը ցույց տվեց, որ դիաֆինի պարաֆինային հատվածներից մեկուսացված ԴՆԹ-ի որակը զգալիորեն բազմազան է: Հատվածների տարբեր միջին երկարությունների ԴՆԹ-ն ներկա էր քաղվածքների, կախված ամրագրման մեթոդից: ԴՆԹ-ն պահպանվել է միայն այն ժամանակ, երբ ամրագրված է հայրենի սառեցված նմուշներում եւ բուֆերացված չեզոք ֆորմալինում: Խստորեն թթվային Bouin Fixative կամ Unfuffered, Formic- ի պարունակությամբ ֆորմալինի օգտագործումը հանգեցրեց ԴՆԹ-ի զգալի կորստի: Մնացած խմբակցությունը խիստ մասնատված է:
Ձախ կողմում բեկորների երկարությունը արտահայտվում է կիլոբազ զույգերով (KBP)

Գծապատկեր 2 | Նուկլեաթթվի թիրախների ամբողջականության կորուստ
(Ա) 3'-5 'բացը երկու տողերի վրա կհանգեցնի թիրախային ԴՆԹ-ի ընդմիջմանը: ԴՆԹ-ի սինթեզը դեռ տեղի կունենա փոքր հատվածի վրա: Այնուամենայնիվ, եթե Primer Canning կայքը բացակայում է ԴՆԹ-ի հատվածում, տեղի է ունենում միայն գծային ուժեղացում: Առավել բարենպաստ դեպքում բեկորները կարող են միմյանց վերափոխել, բայց եկամտաբերությունը կլինի փոքր եւ ցածր հայտնաբերման մակարդակներից:
բ) Հիմքերի կորուստը, հիմնականում կրճատված եւ Thymidine Dimer- ի ձեւավորման պատճառով, հանգեցնում է H- պարտատոմսերի քանակի նվազման եւ TM- ի անկում: Երկարացված տաքացման փուլում նախապատվությունը կհեռացվի մատրիցային ԴՆԹ-ից եւ չի ձգտի նույնիսկ ավելի քիչ խիստ պայմաններով:
գ) հարակից Thymine հիմքերը կազմում են TT DIMER:
Մեկ այլ ընդհանուր խնդիր, որը հաճախ առաջանում է մոլեկուլային ախտորոշման մեջ, թիրախային նուկլեինաթթուների պակաս-օպտիմալ թողարկումն է, համեմատած ֆենոլ-քլորոֆորմի արդյունահանման հետ: Ծայրահեղ դեպքերում դա կարող է կապված լինել կեղծ բացասականությունների հետ: Շատ ժամանակ կարող է փրկվել լիզի լիզի կամ բջջային բեկորների ֆերմենտային մարսողությունը, բայց այս մեթոդը հաճախ հանգեցնում է ցածր ներխուժման զգայունության `միջուկային թթվային անբավարար ազատման պատճառով:

Ուժեղացման ընթացքում պոլիմերազային գործունեության խանգարում

Ընդհանուր առմամբ, խանգարումն օգտագործվում է որպես բեռնարկղային հայեցակարգ `նկարագրելու բոլոր գործոնները, որոնք հանգեցնում են PCR ենթաօրենսդրական արդյունքների: Խստորեն կենսաքիմիական իմաստով խանգարումը սահմանափակվում է ֆերմենտի գործունեությամբ, այսինքն, դա նվազեցնում կամ կանխում է ենթաշերտի արտադրանքի վերափոխումը ԴՆԹ պոլիմերազի կամ դրա կոֆակտորի ակտիվ տարածքի հետ փոխգործակցության միջոցով (օրինակ, MG2 + `TAQ DNA պոլիմերազի ակտիվության հետ փոխգործակցության միջոցով:
Նմուշի կամ տարբեր բուֆերների եւ բուջադրիչների քանակի բաղադրիչները կարող են ուղղակիորեն խանգարել ֆերմենտը կամ ծուղակել դրա կոֆակտներին (օրինակ, EDTA), դրանով իսկ անցնելով PCR- ի պոլիմերազը:
Այնուամենայնիվ, արձագանքման բաղադրիչների եւ նպատակային պարունակող նուկլեինաթթուների միջեւ շատ փոխհարաբերություններ են նշանակվում նաեւ «PCR խանգարող»: Երբ բջջի ամբողջականությունը խաթարում է մեկուսացման միջոցով, եւ նուկլեաթթունը ազատվում է, կարող են առաջանալ նմուշի եւ շրջակա միջավայրի եւ ամուր փուլի միջեւ փոխհարաբերությունները: Օրինակ, «Scavengers» - ը կարող է կապել միայնակ կամ երկկողմանի ԴՆԹ-ն ոչ կովալենտային փոխազդեցությունների միջոցով եւ միջամտել մեկուսացման եւ մաքրման միջոցով `նվազեցնելով թիրախների քանակը, որոնք, ի վերջո, հասնում են PCR ռեակցիայի նավի:
Ընդհանուր առմամբ, PCR ինհիբիտորները ներկա են մարմնի հեղուկների եւ ռեակտիվների մեծ մասում, որոնք օգտագործվում են կլինիկական ախտորոշիչ թեստերի համար (Ուրեա մեզի մեջ, հեմոգլոբինի եւ հեպարինի մեջ արյան մեջ), դիետիկ հավելանյութեր (օրգանական բաղադրիչներ, գլիկոգեն, ճարպեր) եւ բաղադրիչները շրջակա միջավայրում (ֆենոլներ, ծանր մետաղներ)

Ավելի տարածված PCR ինհիբիտորներ կարելի է գտնել բակտերիաներում եւ էվալիոտիկ բջիջներում, ոչ նպատակային ԴՆԹ-ում, հյուսվածքների մատրիցների եւ լաբորատոր սարքավորումների ԴՆԹ-ի պարտադիր մակրոմոլեկուլներ, ինչպիսիք են ձեռնոցներն ու պլաստմասսաները: Արդյունահանման ընթացքում կամ դրանից հետո նուկլեաթթուների մաքրումը PCR ինհիբիտատորները հեռացնելու նախընտրելի մեթոդ է:
Այսօր տարբեր ավտոմատացված արդյունահանման սարքավորումներ կարող են փոխարինել բազմաթիվ ձեռնարկային արձանագրություններ, բայց թիրախների 100% վերականգնում եւ (կամ) մաքրում երբեք չի հաջողվել: Հնարավոր խանգարողներ կարող են առայժմ ներկա լինել մաքրված նուկլեինաթթուներին կամ կարող են արդեն ուժի մեջ մտնել: Կան տարբեր ռազմավարություններ `խանգարողների ազդեցությունը նվազեցնելու համար: Համապատասխան պոլիմերազի ընտրությունը կարող է էական ազդեցություն ունենալ խանգարող գործունեության վրա: PCR- ի խանգարման նվազեցման այլ ապացուցված մեթոդներ մեծացնում են պոլիմերազի կենտրոնացման կամ հավելումների կիրառումը, ինչպիսիք են BSA- ն:
PCR- ի ռեակցիաների խանգարումը կարող է ցուցադրվել ներքին գործընթացի որակի վերահսկման (IPC) օգտագործմամբ:
Պետք է խնամք ձեռնարկվի արդյունահանման հավաքածուի բոլոր ռեակտիվները եւ այլ լուծումները հանելու համար, ինչպիսիք են էթանոլը, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, ISOPROPANOL եւ PHENOL, նուկլեաթթվից, լվացքի մանրակրկիտ քայլով մեկուսացված: Կախված նրանց համակենտրոնացումից, նրանք կարող են ակտիվացնել կամ խանգարել PCR- ին: